El examen físico puede confirmar la presencia de fiebre, dolor con la palpación y edema de los ganglios linfáticos y otros síntomas.  Puede haber enrojecimiento de la garganta, sin secreciones o pus. 
El médico puede suponer un diagnóstico de síndrome de fatiga crónica sólo después de descartar toda otra causa conocida posible de fatiga, como por ejemplo:

• Infecciones
• Trastornos autoinmunes o inmunológicos
• Tumores
• Enfermedades musculares o neurológicas (como esclerosis múltiple)
• Enfermedades endócrinas (como hipotiroidismo)
• Enfermedades psiquiátricas o psicológicas, en especial depresión (ya que este síndrome podría estar asociado con depresión; el diagnóstico de depresión no excluye el SFC, pero se debe descartar que la fatiga esté relacionada solamente con la depresión para diagnosticar SFC)
• Drogodependencia
• Otras enfermedades (como enfermedades cardíacas, renales o hepáticas)

Para diagnosticar SFC debe haber:

• Fatiga extrema y prolongada
• Ausencia de otras causas de fatiga crónica (excepto depresión)
• Al menos 4 de los otros síntomas mencionados

No existen pruebas específicas para confirmar el diagnóstico de SFC, aunque por lo general se realizan varios estudios diferentes para excluir otras causas posibles de los síntomas.
En los estudios se observan algunos hallazgos típicos que, si bien no son lo bastante específicos para diagnosticar SFC, aparecen sistemáticamente en pacientes a los que luego se les diagnostica este trastorno. Algunos hallazgos son:

• Niveles más altos de glóbulos blancos específicos (células T CD4) en comparación con otros tipos de glóbulos blancos (células T CD8)
• Resonancia Magnética de cerebro en la que se observa edema cerebral o destrucción de parte de las células nerviosas (desmielinización)
• Glóbulos blancos específicos (linfocitos) que contienen formas activas de VEB o HHV-6